当前位置: 首页 > >

东师实验4谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定

发布时间:

综合研究性实验四:
谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
一.实验目的
1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶 ALT 的转氨作用; 2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力; 3.学*治疗检测 SGPT 的方法及原理; 4.了解检测肝损伤模型的制备及 SGPT 在科研中的应用。
二.实验材料与试剂
[一]实验材料
动物肝脏
[二]实验试剂
1.9%NaCl 溶液 2.海砂 3.1%谷氨酸溶液(1%KOH 溶液中和) 4.%丙酮酸钠溶液(用 1%KOH 溶液中和) 5.0.1%KHCO3 溶液 6.0.025%一溴乙酸溶液(用 1%KOH 中和) 7.2%乙酸溶液 8.酚的饱和水溶液
将 2 份酚和 2 份水(按重量计算)混合后,放入分液漏斗中,振荡。静止 24h 以后分层,将下部酚层放入瓶中备用。新配制 的酚展层剂可以反复使用 1 周。

9.0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液 10.0.1%标准谷氨酸溶液 11.0.1%标准丙氨酸溶液 12.1%KOH 溶液
二.谷丙转氨酶活性的鉴定(纸层析法)

[一]实验原理

观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸 被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原,在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。
[二]实验操作

(一)谷丙转氨酶提取液制备

(二)转氨作用

谷丙转氨酶提取液制备方法 2g 肝脏+0.9%NaCl6mL+海砂 200mg
在低温下,研磨成浆 用脱脂棉过滤,得提取液(滤液不清)





0.1moL/L 谷氨酸

0.1moL/L 丙酮酸钠

0.1%KHCO3

0.025%一溴乙酸

煮沸的酶液

酶液

对照管 0.50 0.50 0.50 0.25 0.50


测试管 0.50 0.50 0.50 0.25
— 0.50

加脱脂棉塞,45℃水浴,1.5h,时时振荡内容物

2%乙酸

6滴

6滴

沸水浴 2min,使蛋白质完全沉下,过滤,作层析

(三)纸层析

1.方法

纸层析方法 取圆形层析滤纸 1 张,在圆心处用圆规绘出直径为 3cm 的同心圆 通过中心将滤纸绘成四等分扇形,用毛细管点样 2-4 次(直径不超过 2mm)
在滤纸的圆心上剪一小孔,直径约 1-2mm 取一小滤纸条,将下端剪成刷状,在卷成灯芯插入圆形小孔,不能使灯芯突出纸面
将圆形滤纸*放在盛有层析液(水饱和酚)培养皿上,使灯芯向下与溶剂接触 用大小相同的培养皿盖在滤纸上
溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层,直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约 1cm 处时停止(展层时间为 1h) 80-100℃烘箱干燥,喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液,80-100℃显色
2.实验结果

三.血清谷丙转氨酶活力单位测定
[一]实验原理
本实验用丙氨酸和α -酮戊二酸为底物,经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与 2,4-二硝基苯肼作用生成 2,4-二硝基

苯腙,此物质碱性条件下呈棕红色,其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比,可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较, 即可计算出酶的活力单位数。

[二]实验操作

(一)标准曲线的绘制

1.试剂

(1)1/15 mol/LpH=7.4 的磷酸缓冲液 取 1/15 mol/L 磷酸氢二钠(称取 Na2HPO4 9.47g 或 Na2HPO4·12H2O23.87g,溶于蒸馏水中定容至 1000mL)825mL;1/15 mol/L
磷酸二氢钾(称取 KH2PO4 9.078g 溶于蒸馏水中定容 1000mL)175mL 混合。 (2)GPT 基质液
称 α-酮戊二酸,29.2mg(2 mmol/L)及 α-L-丙氨酸 1.78g(200mmol/L)溶于 50mL,pH=7.4 的磷酸缓冲液中,加 0.1mol/L NaOH 溶液 0.5mL,调 pH 为 7.4,然后加磷酸缓冲液定溶至 100mL,加少许氯仿防腐,置冰箱中可保存一周。 (3)1mmol/L2,4-二硝基苯肼
称取 2,4-二硝基苯肼 20mg,溶解于 10mL 浓盐酸中,以蒸馏水定容至 100mL。 (4)2μ mol/mL 丙酮酸钠标准液
精确称取丙酮酸钠 22mg,加磷酸缓冲液溶解后,定容至 100mL。临用前配制。 (5)0.4mol/LNaOH 溶液
2.方法





丙酮酸钠标准液(mL)

对照管

测定管

0

1

2

3

4

5

— 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

GPT 基质液(mL)

0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25

pH7.4 磷酸缓冲液(mL) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10

充分摇匀后,置于 37℃水浴,保温 10min

2,4-二硝基苯肼(mL) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

充分摇匀后,置于 37℃水浴,保温 20min

0.4mol/LNaOH(mL)

5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00

充分摇匀后,室温静置 30min 后,520nm 波长下比色

A 值 520nm

相当丙酮酸含量(mol)

— 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50

相当 GPT 单位(100mL)

— 100 200 300 400 500

以酶的活力单位数为横坐标,以光吸收值为纵坐标,绘制 A520nm 与对应的酶活 力单位数的标准曲线。

(1)丙酮酸钠标准液 mL 数×摩尔浓度(2μ mol/mL); (2)GPT 活力单位为:每 mL 血清在 37℃与 pH=7.4 的基质液作用 60min,生成 1

μ mol 丙酮酸为一个单位(U)。本实验(临床检验)取血清量为 0.1mL,报告数 据以 100mL 血清计算,因此将实际测得结果×1000 即可。

(二)酶活力的测定

对照管





0

GPT 基质液(mL)

0.50

37℃水浴,预温 10min

血清(mL)



PH=7.4 磷酸缓冲液(mL)

0.10

充分摇匀后,置于 37℃水浴,保温 60min

2,4-二硝基苯肼(mL)

0.50

测定管 1
0.50
0.10 0.00
0.50

充分摇匀后,置于 37℃水浴,保温 20min

0.4mol/LNaOH(mL)

5.00

5.00

摇匀后,静置 30 分钟,520nm 波长下比色

A 值 520nm

查标准曲线的对应值,可得 100mL 血清中谷丙转氨酶的活力单位数

(三)实验结果

试管

比色杯吸光值

对照管

测定管

查标准曲线得 GTP 单位

参考数值 GTP 单位

吸光值

纯吸光值

(四)注意事项

1.所需试剂如基质液、丙酮酸标准液、2,4-二硝基苯肼等均需冷藏; 2.为防止溶血及其他因素对酶活性影响,实验所用器皿应干净、干燥方可使用; 3.丙酮酸钠极易变质,配试剂时应选择外观洁白干燥者,否则应进行重结晶; 4.转氨酶只能用于α -L-Ala,对 D-Ala 无催化作用。实验室多用α -L-Ala,是因为便宜,如果采用α -L-Aa,则用量需减半; 5.如活性高于 500U/100mL,应将血清稀释一定倍数重新测定,结果应×稀释倍数; 6.为保证操作结果可靠,测定酶活性时应恒定 pH、保温时间; 7.选用固定分光光度计及比色杯减少误差。
四.GPT/ALT 在临床诊断意义及检测方法原理

[一]GPT/ALT 在临床诊断中的意义
转氨酶广泛存在于机体的各个组织中,在肝组织中谷丙转氨酶活性较高,在心脏中谷草转氨酶活性较高。在正常新陈代谢中, 血清内维持一定水*的转氨酶活性(即正常值)。当组织发生病变时,由于组织细胞肿胀、坏死(或细胞膜破裂),使细胞膜通

透性增高,而导致大量的酶释放至*中,从而引起血清中相应的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著增高。因此测定其活性,对 肝、心脏的某些疾病的临床诊断具有重要的参考价值。
[二]丙氨酸氨基转移酶试剂盒使用说明

(一)用途

本试剂用以测定人血清中丙氨酸氨基转移酶活力。
(二)基本原理

底物 L-丙氨酸与α -酮戊二酸在 ALT 作用下生成丙酮酸,生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下转化成 L-乳酸,同时伴随着 NADH 氧化,引起在波长 340nm 处吸光度下降,下降速率与血清 ALT 活力成正比。
L-丙氨酸+α-酮戊二酸→丙酮酸+L-谷氨酸 丙氨酸+NADH+H+→L-乳酸+NAD+ +H2O
(三)试剂盒组成

(四)仪器

试剂

成分

含量

Tris 缓冲液(pH=8.5)

0.1mol

溶液 A

NADH

0.30mmol

LDH

≥5.0KU/L

Tris 缓冲液(pH=7.0)

0.1mol

溶液 B

L-丙氨酸

1020mmol

α -酮戊二酸

36mmol

1.具有能在波长 340nm 处测定生化分析仪 2.30℃、37℃水浴箱 3.定时器 4.准确的加样器

(五)方法 1.二步法
2.一步法
(六)实验结果

试管

样本管

空白管

样本

0.3mL



蒸馏水



0.3mL

溶液 A

2.0mL

2.0mL

混匀、放设定温度 5min

溶液 B

1.0mL

1.0mL

混匀,准确记录时间,放设定温度 1min 后,在波长 340nm 处,以蒸馏水

校零,连续监测 1-2min,计算Δ A/min。

试管

样本管

空白管

样本

0.3mL



蒸馏水



0.3mL

工作液

3.0mL

3.0mL

混匀,准确记录时间,放设定温度 1min 后,在波长 340nm 处,以蒸馏水

校零,连续监测 1-2min,计算Δ A/min。

工作液制备:溶液 A 与溶液 B 以 2:1 混合,组成测定工作液。工作液在 2-8℃

避光保存,可稳定 3 周。

序号

1

2

3

4

吸光值

Δ A/min

计算公式 计算结果 参考数值
(七)注意事项
1.本液体试剂按 IFCC 推荐法为基础设计,采用二步法,可防止胆红素的干扰; 2.试剂与样本量可按生化分析仪要求衡比例改变; 3.本试剂线性可达到 600 U/L(30℃),或 1000 U/L(37℃),当样本中 ALT 活力超过 600 U/L(30℃)或 1000 U/L(37℃)时, 可用生理盐水稀释,即 0.1mL 血清加 0.2mL 生理盐水,测定,结果×3; 4.如试剂变混,或以蒸馏水为空白,工作液在 340nm 处吸光度<1.0,请勿使用; 5.贮存条件与有效期(试剂在 2-8℃,避光保存,有效期为 1 年;如用一步法,工作液在 2-8℃避光保存,可稳定 3 周)。
五.检测 SGPT 活性在科学研究中的应用
[一]基本原理
测定 SGPT 活性可反映出肝细胞的坏死程度,因此是检测肝功能损坏的灵敏指标之一。很多有毒物质易引起肝损伤,造成肝 实质细胞的变性及坏死,例如,四氯化碳(CCl4)等化学药物可以诱发动物发生急性中毒性肝炎和肝坏死。因此建立由 CCl4 诱发 病变的动物模型,然后检测 SGPT 活性,常被用于滋肝补肾中草药物的筛选研究。
[二]应用实例
红缘层孔菌多糖对 CCl4 中毒小鼠转氨酶(SGPT)活性的影响。 将体重 20-22g 小白鼠随机分为三组,每组 10 只。第 1 组为正常对照,第 2 组为四氯化碳中毒对照组,第 3 组为给药组。 给药组以 150mg/kg 体重的剂量,给小鼠灌胃红缘层孔菌多糖液,每日一次,连续给药 7 天,其余两组灌胃同体积生理盐水。 于末次给药后 24h,给药组、四氯化碳中毒对照组均按 10mL/kg 体重剂量腹腔注射 0.1%CCl4 豆油溶液,正常对照组注射同体积豆 油,16h 后,对三组小白鼠摘眼球取血制血清,按 King 氏法测定谷丙转氨酶活性(100mL 血清与与基质液在 37℃条件下作用 60min, 每生成 1μ mol 丙酮酸为 1 个活性单位)。结果见下表:
红缘层孔多菌多糖对 CCl4 中毒小鼠 SGPT 活性的影响

组别

SGPT(u%)M±SD

P值

正常对照组

205±17

CCl4 中毒组

336±34

P≥0.05

给药组

217±13

由表中数据可见,红缘层孔多菌多糖可抑制由四氯化碳损伤肝细胞引起的小鼠血清谷丙转氨酶活性的升高。




友情链接: